WB实验中最抓马的问题当属无条带：WB实验内参条带非常漂亮，整齐干净，但是目的条带就是做不出来。

但并不是每一次无条带都是抗体的问题，样本、实验方法都可能导致失败。

怎么找出无条带的原因？以下五个自查，帮你找到问题的根源！

第一式——查抗体

第二式——查样本

第三式——查说明书

第四式——方法互证

第五式——实验操作自查

第一式——查抗体

一抗种属、应用、sensitivity有没有问题？

二抗有没有用错？二抗的应用看一抗种属来源。

注意：如果是厂家未验证过的种属和应用，不推荐使用。

第二式——查样本

确定所用的细胞／组织中表达您的靶标蛋白么？表达丰度如何？

①查阅相关文献；

②查阅以下数据库：

http://www.biogps.org：通过mRNA表达水平给您参考估计不同样本中目的蛋白的表达水平

http://www.uniprot.org：了解目的蛋白可变剪切体、蛋白表达位置、可修饰类型等

http://www.phosphositeplus.org：蛋白质翻译后修饰权威数据库，查阅修饰类蛋白的表达条件和丰度、刺激方式等

第三式——查说明书

产品说明书中都有写明抗体的稀释比例，但这不是一层不变的，需要根据情况适当增加抗体比例。说明书中都列举出相应的配套试剂，这些都是厂家经过实验反复验证后的吐血推荐，保证你你能得到最佳信噪比的结果。

第四式——方法互证

IHC、IF实验在做染色之前，可用WB实验验证样本中是否有表达。

第五式——实验操作自查

样本提取过程：

是否加入蛋白酶或/和磷酸酶抑制剂？是否在冰上操作？

PMSF是单一的丝氨酸酶抑制剂，建议加入protease inhibitor /phosphatase inhibitor cocktail；

是否进行超声？

超声处理能更好的破坏胞膜和核膜释放核蛋白同时打断染色质DNA，最大程度的从细胞中提取靶标蛋白，保证平行样本间裂解的一致性。

蛋白浓度：

根据蛋白定量的结果适当增加上样量至50-80ug；

转膜过程：

转膜效率如何？

采用丽春红染料进行转膜效率的验证；

封闭方法转换？

尝试使用另一种封闭方法；

优化洗涤条件：

洗涤时间勿过久，3次，每次5-10min即可；

抗体孵育过程：

严格筛选的一抗；

稀释比和稀释液的选择：请参照抗体说明书，如未标注，可采用5%脱脂牛奶/TBST或5%BSA/TBST进行稀释；

显影过程：

灵敏度合适的底物；

显色底物避免过度消耗；

显色底物避免放置过久而失活；

实验外包    想了解更多请关注：http://www.do-gene.cn