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一、简单染色法（单染色）
【原理】细菌带负电荷，与带正电荷的碱性染料结合着色
【步骤】一般要经过涂片、固定、染色、水洗和干燥五个步骤
【作用】快速观察细菌基本形态（如球菌、杆菌）、大小及排列方式（链状、簇状）
【常用染料】
l 碱性复红：着色快，时间短，菌体呈红色
l 美蓝：着色慢，时间长，效果清晰，菌体呈蓝色
l 结晶紫：染色迅速，着色深，菌体呈紫色
【注意事项】
l 涂片质量：厚度不均会导致染色深浅不一，菌量过多易堆积，过少则难观察
l 固定温度：火焰固定时需快速通过，避免高温破坏细胞形态
l 染色控制：染色期间勿让染液干涸，否则结晶残留影响观察
l 水洗技巧：水流过急可能冲脱菌膜，应轻柔冲洗
二、负染色法
【原理】生物样品表面带负电荷，酸性染料也带负电荷，因静电排斥无法渗入样品内部，仅沉积在样品周围形成“包埋”效果
【步骤（以悬滴法为例）】
l 样品制备：样品为悬浮液，浓度适中（过高易堆积，过低难寻找）
l 滴样：滴样品悬液于铜网支持膜上
l 染色：待滴样半干时滴加染液，1~2分钟后吸去多余染液，自然干燥
【作用】用于观察病毒形态（如新冠病毒的刺突蛋白）、衣壳组装模式，以及细菌鞭毛、生物膜、外泌体、细胞器等表面结构
【常用染料】
l 磷钨酸：常用1~3%水溶液，pH6.0~7.0，适用于病毒、细菌
l 醋酸铀：0.5~2%水溶液，pH4.2~4.5，对蛋白质和脂质体效果更佳
l 其他：钼酸铵、硅钨酸等
【优化技巧】
l PH控制：中性或弱酸性环境（pH6.7~7.2）可提高染色均匀性
l 分散剂：添加0.01%牛血清白蛋白（BSA）或杆菌肽，防止样品团聚
三、革兰氏染色法
【原理】阳性菌（G*）因细胞壁厚、肽聚糖层致密，保留紫色；阴性菌（G-）脱色后复染呈红色
【步骤】结晶紫初染→碘液媒染→酒精脱色→沙黄/番红复染
【作用】
l 分类鉴定：初步区分细^菌大类，缩小鉴定范围
l 用药指导：G*菌对青霉素敏感，G-菌对链霉素敏感
l 致病机制：G-菌内毒素（脂多糖）致休克，G*菌外毒素致组织损伤
【结果判断】
l G*菌：紫色（如葡萄球菌、链球菌）
l G-菌：红色（如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌）
【注意事项】
l 涂片时，菌膜需薄而均匀，过厚易导致假阳性（脱色不彻底）
l 固定时，载玻片火焰快速通过3次，避免过热破坏细胞壁
l 水洗时，水流不宜过猛，防止菌膜脱落
四、抗酸染色法
【原理】分枝菌酸与石炭酸复红在加热条件下结合形成稳定复合物，不被盐酸乙醇脱色，故抗酸菌呈红色；非抗酸菌因脂质含量低，易被脱色并被复染成蓝色
【步骤】石炭酸复红加热染色→盐酸酒精脱色→美蓝复染
【作用】
l 疾病诊断：结核病、麻风病等
l 鉴别诊断：区分结核性肉芽肿与真菌感染、结节病等类似病变
【结果判断】油镜下观察，抗酸菌呈红色，背景及非抗酸菌呈蓝色
【注意事项】
l 避免假阳性：使用新载玻片和独立竹签制片；染液需过滤，玻片分隔染色防止交叉污染；镜油滴加时避免接触痰膜
l 避免假阴性：确认标本为深部痰（非唾液），量>3ml；优化染色温度和时间，确保分枝菌酸充分结合染料
l 其他质控：复染时间≤1分钟，避免背景过深掩盖抗酸菌；脱色后水洗需彻底，防止残留酸影响复染
五、芽孢染色法
【原理】芽孢壁厚、透性低，着色、脱色均较困难，加热促进孔雀绿渗透进入菌体的染料可经水洗脱色，而进入芽孢的染料则难以透出，再用复染液染色后，芽孢仍然保留初染剂的颜色，而菌体被染成复染剂的颜色，即菌体和芽孢分别染成红色和绿色易于区分
【步骤】涂片固定→孔雀绿初染与加热→水洗脱色→沙黄/番红复染
【作用】
l 食品工业：评估灭菌工艺有效性
l 临床诊断：快速鉴别致病菌，辅助感染诊断
l 环境监测：分布评估生态风险及污染源追踪
l 科研分类：细菌分类与鉴定依据
【注意事项】
l 菌龄控制：选择培养18~24h的菌种。幼龄菌无芽孢，老龄菌芽孢囊易破裂
l 加热技巧：保持染液微沸不蒸干，避免高温导致菌体破裂
l 脱色时间：水洗脱色≤2秒，防止过度脱色影响对比度
l 质控与安全：试剂现配现用，无菌操作防污染，实验人员需穿戴防护装备
六、鞭毛染色法
【原理】
l 媒染剂预处理：使用单宁酸、明矾钾或鞣酸等媒染剂包裹鞭毛，增加其直径并增强染料吸附能力
l 染料沉积：碱性复红、硝酸银或结晶紫等染料与媒染剂结合，沉积在鞭毛上形成可见色带（通常为褐色或红色）
【染色方法】
l 硝酸银法：菌体与鞭毛均呈深褐至黑色
l Leifson氏法：鞭毛红色，细胞蓝色
l Bailey氏鞭毛染色法：鞭毛红色
【作用】
l 微生物分类：通过鞭毛着生方式（单生/丛生/周生）鉴定菌种
l 致病性研究：鞭毛数量与细菌运动能力、侵染机制相关
l 细胞生物学：观察细胞运动、分裂及信号传导机制
【常见问题与技巧】
l 染色失败原因：菌龄过老、玻片不洁、媒染剂失效或加热过度
l 运动性观察辅助：可先用压滴法（美蓝染色）初步判断细菌运动性，再行鞭毛染色
七、荚膜染色法
【原理】荚膜其亲水性强、与染料结合力弱，且受热易变形，故无法通过常规染色显色。因此通过使菌体着色（如红色或紫色）并加深背景颜色（如灰色或黑色），衬托出无色的英膜，形成菌体周围透明圈的效果
【常用方法】
l 湿墨水法：背景灰黑，菌体深色，英膜为亮白透明圈
l Anthony氏法：菌体深紫色，荚膜淡紫色或无色
l 负染色法：背景灰色，菌体红色，英膜透明
l 干墨水法：背景灰色，菌体紫色，英膜透明
l Tyler法：背景蓝紫色，菌体紫色，荚膜无色或浅紫色
【应用场景】
l 病原菌鉴定：如炭疽杆菌的英膜检查，菌体蓝色，荚膜淡蔷薇色
l 环境微生物研究：固氮菌、胶质芽孢杆菌的英膜观察
l 教学实验：湿墨水法操作简单，适合学生掌握负染色原理
【常见问题】
l 英膜未显现：菌种选择错误（如无英膜菌株），也可能加热固定导致变形，或水洗过度冲脱染料
l 背景不均匀：墨水未过滤（含颗粒），或推片力度不均（干墨水法）
八、核酸染色法
【原理】染料与含核酸的物理-化学结合。细菌等电点较低（pH2~5），带负电荷的核酸易与带正电荷的碱性染料（如结晶紫、美蓝）结合。酸性染料（如刚果红）需调至强酸性环境（pH<菌体等电点）才能使菌体带正电荷而结合
【常用方法】
l 荧光染料（吖啶橙）：染料在双链DNA中呈单体态（绿光），在单链RNA中形成二聚体（红光），实现核酸类型区分
l 亚甲蓝：特异性染DNA为深蓝色，主要用于组织切片或细胞涂片的DNA定位，操作简便、成本低，但灵敏度低于荧光染料
【应用场景】
l RNA动态监测：吖啶橙标记细胞质RNA（橙红色），定量分析转录活跃度（如肿瘤细胞中RNA异常高表达）
l 原位杂交辅助：结合荧光探针（如FISH），精确定位特定基因的转录位点
l DNA复制与周期：吖啶橙染色显示分裂期染色体浓缩（强绿光），间期染色质松散；亚甲蓝揭示有丝分裂中染色体排列异常（如癌变细胞非整倍体）
l 凋亡与坏死鉴别：凋亡细胞核碎裂（吖啶橙点状绿光），坏死细胞RNA泄漏（红光弥散）
九、荧光染色法
【原理】荧光染料（如金胺O、钙白）通过静电作用、疏水作用或抗原-抗体反应，与微生物细胞壁（如真菌的几丁质、细菌的肽聚糖）或核酸（DNA/RNA）结合；染料吸收特定波长的激发光（如紫外光或蓝光），电子跃迁后释放更长波长的发射光（如绿色或红色荧光），形成可观察的荧光信号
【常用方法】
【注意事项】
l 荧光衰减：染色后24h内完成观察（如金胺O染色样本）
l 背景控制：使用无自发荧光的载玻片，避免血细胞或杂质干扰（如溶解红细胞预处理）
l 染料毒性：部分染料（如吖啶橙）具潜在致癌性，需严格防护
l 光漂白现象：长时间照射导致荧光衰减，影响定量准确性
【应用】
l 快速病原检测：真菌荧光染色（30~60分钟）比培养法（7~30天）更快诊断肺部真菌感染
l 水/食品污染检测：吖啶橙染色快速计数水中活菌
十、金属染色法
【原理】基于金属离子与细胞成分（如细胞壁多糖、蛋白质、核酸）的物理吸附、化学结合或氧化还原反应，形成显色或高对比度的沉淀物
【常用方法】
【注意事项】
l 避免假阳性/假阴性：银染时脱色不彻底可能导致背景过深；鞭毛染色时需轻触水滴防鞭毛脱落
l 试剂稳定性：银染液需现配现用
l 生物安全：分枝杆菌等病原体需在生物安全柜操作
【应用】
l 快速病原识别：六胺银染色用于肺孢子菌肺炎诊断，灵敏度高于常规染色
l 混合感染鉴别：同步检测真菌、细菌（如诺卡菌与曲霉菌）
l 结构解析：鞭毛染色揭示细菌运动机制，铁染色分析胞内代谢
l 环境微生物互作：研究微生物对重金属（如铜）的吸附与转化
l 重金属污染治理：利用微生物（如铜绿假单胞菌）吸附水体中的金属离子
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