所谓的内参抗体，我们可以从字面上来解释，就是内部参照抗体，它和目的抗体没有直接联系，而是一种精准制备抗体的辅助抗体。

比如我们需要对不同条件或不同组织细胞中表达的目的蛋白的相对多少进行比较，那么就需要有相同的定量，这样才会具备比较的基础。

但是在实验中，可能会因为蛋白浓度不太精准，或者在上样蛋白的时候，因为操作而产生偏差，这个时候，就需要有一款内部参照抗体来进行校正作用。这类抗体需要在冉细胞或组织间具备恒定的表达特性，而且表达量要高。这类抗体，我们称之为内参抗体。

内参抗体蛋白对于评估蛋白质免疫印迹法的效率和比较凝胶中每孔的蛋白上样量至关重要。此类对照可帮助确定样品间表达水平的差异是由细胞裂解物的实际蛋白水平导致，还是由上样量的差异导致。

此外在WB实验中使用内参作为空白对照，还可以检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常、排除边界效应。内参抗体的选择原则

没有一种内参蛋白适用于所有样本的Western Blot，要根据自己的样本选择合适的内参。

内参抗体种类有很多，根据蛋白的亚细胞定位，可以将其分为全细胞或胞浆内参、膜内参、核蛋白内参等，比如β-actin、β-tubulin、GAPDH、LaminB等。关于内参选择，我们一般遵循以下几大原则：

1、样本种属来源

①哺乳动物的组织/细胞样本，一般选择β-actin、β-tubulin、GAPDH、Lamin B、Histone H3等内参。

②植物来源实验样本则可以选择Plant actin、Rubisco等内参。

③在研究跨物种的蛋白质时，选择具有适当跨物种反应性的上样内参。

④其他稀少物种来源研究较少，可以参照文献指导选择内参，或者是选择保守基因高表达的管家基因（GAPDH、Actin和Tubulin最常用的三个内参，它们在几乎所有的哺乳动物细胞中均有高表达，是最常用的胞浆或全细胞内参。）

2、目的蛋白分子量

目标蛋白和内参蛋白大小相当的话，WB 结果无法直接观察，很难进行准确数据的分析。因此要选择分子量与目的蛋白质差异较大的内参抗体，以确保两种蛋白质在检测过程中不会重叠。

一般应该保证目的蛋白与内参蛋白分子量相差5kDa以上但不要差距太大。比如目的蛋白分子量为45 kDa，此时不适宜选择β-actin，可以考虑选择 GAPDH 或者β- tubulin。

3、目的蛋白表达部位

一般的蛋白质检测，GAPDH、β-Actin 或β-Tubulin 可以满足要求。

如果需要检测亚细胞器蛋白的时候，需要选择对应亚细胞器内参，这样更能体现内部参照的准确性。

核内参抗体有Lamin A、Lamin B、TBP、YY1、Histone-H3；

膜蛋白检测内参抗体有ATP1A1；

线粒体蛋白检测内参抗体有VDAC1和COXIV。

4、宿主

如果要进行多重免疫印迹（使用同时靶向目标蛋白和和内参抗体的一抗探针），则所选内参

抗体的宿主应不同于靶向目标蛋白的一抗宿主。

5、特殊实验条件

需要特别注意的是内参的选择还须考虑实际实验环境状况。在设计实验方案时应考虑这些因素的影响并查询相关文献，如果在实验过程中出现内参表达出现异常状况应及时分析原因并调整内参选择。

①如某些细胞或组织由于缺氧、糖尿病等因素会导致GAPDH的表达量增高，此种状况下GAPDH不适合做内参。

②研究结肠癌的发生及转移时，细胞骨架蛋白Vinculin不适合做全细胞的内参。近期研究表明，结肠癌中Vinculin表达的减少和增加与致癌和转移有关联。

③在细胞增殖相关实验中，c-Jun由于自身表达变化就不适合做内参。

④在凋亡实验中，TBP、Lamin等不适合作为核内参。

⑤做各种分泌液样本的时候，如血浆、乳汁、组织液等，由于没有完整的细胞结构，只能选择一些分泌蛋白作为内参，比如Transferrin。

⑥在做多组织多细胞样本对比表达量时，最好选用GAPDH作为内参，因为GAPDH作为代谢蛋白，在活组织中表达比较恒定。而β-Actin和β-Tubulin是结构蛋白，不同组织的细胞结构会有差异性。

⑦检测磷酸化、乙酰化等修饰型蛋白时，要选择β-actin和β-Tubulin等结构蛋白作内参。

⑧在研究蛋白质翻译后修饰（PTM）时，使用未经修饰或完整的目标蛋白作为内参抗体，效果优于通用内参抗体。

常用的内参抗体

1、β-Actin

Actin即肌动蛋白，是细胞的一种重要骨架蛋白。

Actin大致可分为六种，其中四种是不同肌肉组织特异性的，其余两种广泛分布于各种组织中，包括 β-actin和γ-non-muscle actin。β-actin作为内参是得到了公认的，这是针对大多数组织和细胞来说的，它广泛分布于细胞浆内，表达量非常丰富，其含量占所有细胞总蛋白的50%。

但是在一些少量特殊的情况下，如脂肪组织或细胞内，β-Actin的表达量就很少。β-actin由375个氨基酸组成，分子量大小为42KD左右。

2、Tubulin

Tubulin即微管蛋白，是细胞的一种骨架蛋白。

Tubulin分为α、β、γ、δ、ε等多种tubulin，其中α-Tubulin和β-Tubulin可以形成异源二聚体，是形成微管的最主要的两种Tubulin。α-tubulin和β-tubulin实际检测条带均在55kDa左右。

作为内参，β-tubulin的蛋白水平通常不会发生改变，因此被广泛用于Western Blotting时上样量是否一致的参照，也常被用于免疫染色观察细胞的微管结构。

3、GAPDH

GAPDH即甘油醛-3-磷酸脱氢酶，是参与糖酵解的一种关键酶，催化糖酵解的第六步，它还参与核转录等事件，核糖核酸转录、DNA复制和修复以及细胞凋亡。由4个30-40kDa的亚基组成，分子量146kDa，检测条带大约在36kDa。

GAPDH基因几乎在所有组织中都高水平表达，广泛用作Western Blotting的内参。请注意，某些生理因素，如缺氧和糖尿病，会增加GAPDH在特定的细胞和组织的表达。

其它内参

Lamin B1（核纤层蛋白 B1），分子量约为66-72kDa，常用作核膜内参。

Histone-H3（组蛋白 H3），分子量约为15-17 kDa，常用作核内参。

ATP1A1（钠/钾离子转运ATP酶α1肽），分子量约为97-110 kDa，常用作膜内参。

COX4I1（细胞色素C氧化酶亚基Ⅳ亚型1），分子量约为17-20kDa，常用作线粒体内参。

Transferrin（转铁蛋白），分子量约为77kDa，可作为全血/血浆/血清内参蛋白。

以上提到的并不是全部，还有很多靶标可以作为各种样本的内参蛋白。

总之，对于WB实验而言，没有内参作为参照，或者内参选择不合适，实验结果就会完全失去意义。针对不同目的蛋白，我们要依照其蛋白特性和实验条件差异化的选择最佳内参。

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