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样品准备：实验第一步是准备样品。如果是贴壁细胞，先把爬片在70%乙醇里泡一会儿消毒，再用无菌镊子夹到培养皿里，用无菌PBS洗洗残留乙醇，然后把细胞接种到爬片上，过夜培养，等细胞长成单层，小心取出爬片就行。要是细胞不小心脱落，实验就得重来。悬浮细胞则要提前处理爬片，让细胞能贴壁，一般几小时就行，后续接种操作和贴壁细胞一样。
固定：固定细胞常用的甲醛浓度是2% - 4%，室温下固定20分钟左右。比如用4%多聚甲醛固定爬片15分钟，再用PBS浸洗3次，每次3分钟，洗掉多余固定剂。但如果实验用到磷酸化抗体，甲醛可能会让磷酸蛋白从细胞膜表面跑到胞浆里，这时候就得用冰冷的无水甲醇或无水乙醇来固定。
通透：这一步是为了让抗体能进入细胞内部。用0.5% Triton X - 100（用PBS配制），室温处理20分钟，就能在细胞膜上开个小通道。如果目标抗原就在细胞膜上，这步就可以省略。
封闭：通透后，先用PBS浸洗3次，每次3分钟，再用吸水纸吸干PBS，然后选好封闭液，常用的有和二抗同一来源的血清、BSA或羊血清。室温封闭60分钟，从这一步开始，要注意保持样品湿润，否则背景信号会升高，影响实验结果。
一抗孵育：按一抗说明书，用一抗稀释液稀释好一抗，吸尽封闭液后，滴加到每张玻片上，放进湿盒，4℃孵育过夜。第二天回收一抗，用PBST洗涤3次，每次5分钟，洗掉未结合的一抗。一抗可以回收，在-20℃保存，一般能重复使用3次左右，具体看抗体的灵敏度。
荧光二抗孵育：吸尽洗涤液后，滴加稀释好的荧光二抗，湿盒里孵育1小时。回收二抗，用PBST洗3次，每次5分钟。从加荧光二抗开始，后面操作都要避光，防止荧光淬灭。二抗孵育时间通常1 - 2小时，常温操作。选择二抗时，不能和一抗属性相同，否则容易串色。洗涤时，一抗用PBS洗，二抗用TBST，适当增加吐温浓度，洗涤效果更好。
复染核：在玻片上滴加DAPI，避光孵育5分钟，给细胞核染色。然后用PBST洗3次，每次5分钟，洗掉多余DAPI，这样就能清晰区分细胞核和其他细胞结构。
封片及荧光观察：用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片，最后在荧光显微镜下观察，记录实验结果。
免疫荧光实验中串色问题解析
在免疫荧光实验里，串色问题特别烦人。串色，简单说就是多重荧光染色时，不同荧光染料的信号混到一块儿，分不清彼此。这就跟音乐会一样，每个乐器都有自己的声音，要是混成一团，旋律就乱了，实验结果也跟着出错。
想想看，你辛辛苦苦做实验，想看看两个蛋白是不是挨在一起，结果因为串色，把本来不在一起的蛋白误以为是共定位，还据此得出错误结论，那前面的努力不就白费了？串色直接影响荧光信号的纯度，对实验结果的准确性影响特别大，必须重视起来！
避免串色的实用 Tips
细胞准备注意事项
细胞铺板时，密度一定要控制好。铺得太密，一抗结合位点太多，非特异性染色的风险就高，还会影响拍摄效果。比如，从6孔板取1/8的细胞量铺到12孔板里，培养12小时左右，密度就比较合适，能有效减少串色风险。在细胞种类选择上，大体积细胞（如HeLa细胞）拍摄效果更好，而HEK细胞稍差一些。不过，如果用非工具细胞，就不用太纠结细胞体积了。细胞状态也很关键，健康的细胞染色效果好，要是细胞被支原体污染，会出现严重的非特异性染色，甚至核染色和抗体染色都会异常。所以实验前一定要做好支原体清除工作。
抗体使用要点
抗体的正确使用是避免串色的关键。研究外源蛋白时，用标签抗体，特异性高，用量少，一般1:500左右就行。如果是染内源性蛋白，一抗浓度可以提高到1:200左右，但一定要仔细查阅抗体说明书，确认它是否适合免疫荧光实验。一抗孵育时，4℃过夜孵育能让抗体和抗原充分结合，效果更好。一抗还能回收，在-20℃保存，一般能重复使用3次左右。在双抗体免疫荧光实验中，抗体组合很重要，要选不同宿主来源的抗体，比如一个小鼠抗体，一个兔抗体，千万别选双小鼠或双兔抗体，不然容易交叉反应导致串色。二抗孵育时间一般1 - 2小时，常温进行，注意避光。选择二抗时，别和一抗属性相同，否则容易串色。洗涤时，一抗用PBS洗，二抗用TBST（TBS + 0.05% Tween - 20），适当增加吐温浓度，能把没结合的二抗洗得更干净，减少串色。
染色与拍摄技巧
染色顺序也很重要。在双抗体染色实验里，核染色要放在最后一步。别在实验一开始就用活细胞染核液（如Hoechst），而是在封片时用DAPI进行核染色，同时要控制好DAPI的浓度，低浓度就能达到不错的效果，浓度太高容易串色。拍摄时，激发光的选择是避免串色的最后一道防线。封片后拍摄，要选没有交叉波长的激发光，比如绿光488 nm和红光555 nm，这样能让不同荧光信号互不干扰，清晰捕捉到每个荧光信号，得到准确的实验结果。
实验中的其他常见问题与解决办法
在免疫荧光实验里，串色只是个麻烦事，其他问题也常冒出来添乱。比如信号弱，可能是因为抗体浓度过低、抗原表达量少，或者抗原修复不充分。这时候就得调整抗体浓度、检查样品质量，或者优化抗原修复条件，让信号变强。
背景染色也很烦人，就像照片上有噪点，可能是封闭不充分、抗体非特异性结合，或者洗涤不彻底。解决办法就是优化封闭条件、选特异性高的抗体，多洗几次，洗得彻底些，让背景干净。
这些问题都得在实验中仔细排查，找到原因，才能顺利实验，得到可靠的结果。
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