01什么是荧光素酶和双荧光素酶？

荧光素酶报告基因检测是以荧光素（luciferin）为底物来检测萤火虫荧光素酶（Firefly Luciferase）活性的一种报告系统。荧光素酶可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的过程中，会发出生物荧光（bioluminescence），可通过荧光测定仪设备测定luciferin氧化过程中释放的生物荧光，常应用于miRNA靶基因验证及启动子转录活性调控等方向研究。

利用荧光素酶与底物结合发生化学发光反应的特性，把感兴趣的基因转录的调控元件克隆在萤火虫荧光素酶基因的上/下游，构建成荧光素酶报告质粒。然后转染细胞，适当刺激或处理后裂解细胞，测定荧光素酶活性。通过荧光素酶活性的高低判断刺激前后或不同刺激对感兴趣的调控元件的影响。

双荧光素酶通常是指萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶。萤火虫荧光素酶是从甲虫（Photinus pyralis）中分离得到，分子量为61kDa；海肾荧光素酶（Renilla Luciferase）则是从海肾（Renilla reniformis）中分离，分子量为36kDa。

02两种酶的区别？

1. 底物和辅因子不同：萤火虫荧光素酶需要荧光素、氧气、ATP和镁离子同时存在才能发光；而海肾荧光素酶仅需要腔肠素（coelenterazine）和氧气。

2. 发光的颜色不同：萤火虫荧光素酶产生的光颜色呈现黄绿色，波长550-570nm；而海肾荧光素酶产生蓝光，波长480nm。正是由于这两种酶的底物和发光颜色不同，所以在双报告实验中得到广泛应用。

03为什么采用双荧光素酶报告系统？

单报告基因实验往往会受到各种实验条件的影响，而双报告基因则通过共转染的“对照”作为内参为试验提供一基准线，从而可以在最大程度上减小细胞活性和转染效率等外在因素对实验的影响，使得数据结果更为可信。一般情况下，海肾荧光素酶基因作为内参使用，将带有海肾荧光素酶基因的质粒与报告基因质粒共转染细胞；或是将两个报告基因构建到同一个质粒上，分别用不同的启动子启动其表达。计算结果时，将萤火虫荧光素酶的检测值比上海肾荧光素酶检测值（Firefly Luciferase/ Renilla Luciferase），这样就可以减少内在变化因素对实验准确性的影响，相当于做了标准化，使测试结果不受实验条件变化的干扰。

04双荧光素酶报告基因检测

有哪些常用的载体？

1. 两种荧光素酶分别位于两个载体上。

（1）pMIR-REPORT载体

它用来插入miRNA靶序列，评估细胞内miRNA功能。该载体包含一个CMV启动子控制下的萤火虫荧光素酶报告基因。在荧光素酶基因的3'UTR区域包含一个多克隆位点，用于插入预测miRNA的结合靶序列或其他核苷酸序列。若荧光素酶活性下降，说明该段插入序列受到miRNA调节，这模仿了miRNA靶序列的作用方式。

（2）pGL3系列载体

PGL3系列载体包括Promoter、Enhancer、Basic以及Control，都含有萤火虫荧光素酶报告基因，其中Control为对照载体；Basic仅含有一个Luc基因，无启动子与增强子；Promoter含有SV40启动子，可用于检测增强子；Enhancer则与之相反，即含有增强子，可用于检测启动子。

（3）pRL系列载体

pRL系列载体为海肾荧光素酶报告载体，由Promega公司开发，其载体间最主要的区别是携带的启动子不同，包括CMV、SV40、TK等，即pRL-CMV、pRL-SV40、载体，将F-Luc载体与其共转染293细胞时，pRL系列载体起发挥内参作用。

注：通常，内参基因表达的活性应当显著高于背景组，同时，尽量小，确保不干扰主报告基因的表达。因此，建议选择内参载体时，首先考虑活性较弱的TK启动子驱动的载体。当通过文献资料或者预实验，发现该载体在目标细胞模型中表达效率过低，或者会受到实验研究因素干扰时，再考虑其他表达活性更强的载体，或自己构建所需的特殊启动子载体。

（4）pGL4系列载体

pGL4载体系列代表了新一代萤光素酶报告基因载体，有多种基因和启动子配置供用户选择，其骨架模板就是pGL3载体。具体而言，pGL4系列载体是在pGL3载体骨架的基础上，重新设计了载体中从报告基因起始点到细菌的复制序列的起点，以减少共有转录因子结合位点的数量，从而降低异常表达的风险。不仅如此，pGL4载体的其它修饰还包括重新设计多克隆位点、去除f1复制起始点、去除一个内含子序列及减少启动子数量等等。此外，pGL4系列载体还包含携带优化的海肾萤光素酶编码基因Rluc的载体。

2. 两种荧光素酶位于同1个载体上：

（1）pmirGLO载体

考虑到实验偏差、细胞转染难易程度、细胞承受力等问题，研究人员又进一步对双荧光报告系统的载体进行优化，将两种荧光素酶基因引入同一个载体，以实现偏差小、转染易、细胞死亡率降低的目的。

目前，最常用的是Promega公司研发的pmirGLO载体，以PGK中等强度启动子启动的萤火虫萤光素酶基因（luc2）为主报告基因，以海肾萤光素酶基因（hRluc-neo）作为内参报告基因，载体上带有抗性基因，可作为稳定转染筛选标记。

（2）psiCHECK系列载体

psiCHECK系列载体最初是为验证siRNA靶标而设计的，但介于其是以R-Luc为主报告基因，而F-luc作为内参报告基因，与大部分实验者的使用习惯相悖，且酶切位点少，SV40启动子活性高，不适用于miRNA相关研究。

05双荧光素酶报告基因的主要应用方向：

1. 转录因子-启动子

启动子能活化RNA聚合酶，使之与模板DNA准确地相结合并具有转录起始的特异性；转录因子（TFs）调节基因表达，保证目的基因以特定的强度在特定的时间与空间表达的蛋白质分子。将启动子区域序列插入到报告基因载体（常用载体为pGL3-Basic Vector，将待检测的启动子序列构建在报告基因上游），同时在细胞实验中共表达转录因子，分析荧光素酶表达水平，反应转录因子是否影响基因表达情况。

（1） 实验分组参考

（2）数据处理

启动子活性检测的数据处理比较简单，将同一样品孔内Firefly Luciferase值与Renilla Luciferase值的比值Firefly /Renilla luminescence作为luciferase相对表达量

（3）数据分析

通过荧光值对比确定哪一区域为核心区，luciferase表达强度显著降低说明转录因子能抑制启动子的启动能力。

2. miRNA-靶基因

3‘UTR是位于编码基因终止密码子下游延伸至多聚A尾巴（Poly-A）的前端，通过自身结构或者与其他分子相互作用调控基因表达，miRNA大部分通过成熟体种子区与3’UTR结合抑制蛋白翻译。将待验证序列插入到报告基因载体的3‘UTR区域，再共转入microRNA，如果荧光素酶表达下降，则待验证序列是miRNA靶序列。

（1）实验分组参考

（2）检测体系中各质粒名称说明

（3）数据处理

a) Firefly /Renilla luminescence：同一样品孔内Firefly Luciferase值与Renilla Luciferase值的比值，代表luciferase相对表达量（消除操作误差）。

b)Firefly /Renilla luminescence fold change：同一Luciferase质粒转染的两个组中，将miRNA-NC组luciferase相对表达量均一化为1，目的miRNA组相比miRNA-NC组后，其luciferase相对表达量（消除在3' UTR空载体质粒下，miRNA质粒和miRNA NC质粒造成的误差，该误差在20%范围内属于正常情况）。

c）Normalized fold change：将UTR-NC组量化为1后，比较在相同的miRNA的作用下，UTR组和UTR突变组的luciferase相对表达量。

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