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本文侧重于介绍动物医学类样本的LC-MS/MS非靶向代谢组学样品前处理方法，样本类型包括血清、动物组织、尿液、粪便（固体/液体）、细胞（或菌体）、培养液（或发酵液），有需要的朋友们记得收藏！！！
A1: 血清
常用等级：★★★★★
1. 将-80 ℃下保存的样本取出，在室温下解冻，移取样本100 μL，加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，为甲醇配置）20 μL，涡旋震荡10 s ；
2. 加入300 μL蛋白沉淀剂甲醇-乙腈（V:V=2:1），涡旋震荡1 min；
3. 冰水浴超声提取10 min，-20℃下静置30 min；
4. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取300 μL上清液装入LC-MS进样小瓶中挥干；
5. 用300μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶，加入内标（Lyso PC17:0，0.1 mg/mL，甲醇配置）10 μL，涡旋30 s，超声3 min；
6. -20℃下静置2小时；
7. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取150 μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析；
8. 质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。
注：血清样本注意溶血情况，严重溶血需谨慎实验。样本不足100uL时，可能有实验风险。
A2: 动物组织
常用等级：★★★★★
1. 精确称取30 mg组织样本到1.5 mL EP管中，加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3mg/mL，甲醇配置）20 μL，加入400 μL甲醇-水（V:V=4:1）；
2. 加入两个小钢珠，在-20℃冰箱中预冷2 min后，放入研磨机中研磨（60 Hz，2 min）；
3. 冰水浴超声提取10 min，-20 ℃静置30 min；
4. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取300 μL上清液装入LC-MS进样小瓶中挥干；
5. 用300μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶，加入内标（Lyso PC17:0，0.1 mg/mL，甲醇配置）10 μL，涡旋30 s，超声3 min；
6. -20 ℃下静置2小时；
7. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取150 μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析；
8. 质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。
A3: 尿液
常用等级：★★★★
1. 取100 μL尿液样本，加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）20 μL；
2. 加入300 μL 甲醇-乙腈（V:V=2:1），涡旋震荡1min；
3. 冰水浴超声提取10 min，-20 ℃静置30 min；
4. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取350 μL上清液装入LC-MS进样小瓶中挥干；
5. 用300μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶，加入内标（Lyso PC17:0，0.1 mg/mL，甲醇配置）10 μL，涡旋30 s，超声3 min；
6. -20℃下静置2小时；
7. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取150 μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析；
8. 质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。
A4: 粪便（固体/液体）
常用等级：★★★★
方法1（粪便固体）
1. 取出冻存的肠道内容物样本约60 mg装入1.5 mL EP管中，加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）20 μL，加入600 μL 甲醇-水（V:V=4:1）；
2. 加入两个小钢珠，在-20℃冰箱中放置5 min后，放入研磨机中研磨（60 Hz，2 min）；
3. 冰水浴超声提取10 min，-20 ℃静置30 min；
4. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取200 μL上清液装入LC-MS进样小瓶中挥干；
5. 用300μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶，加入内标（Lyso PC17:0，0.1 mg/mL，甲醇配置）10 μL，涡旋30 s，超声3 min；
6. -20℃下静置2小时；
7. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取150 μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析；
8. 质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。
注：同一项目应尽量使用同一样本状态的前处理方法。
方法2（粪便液体）
1. 取一定量样本放入1.5 mL 的离心管中；
2. 离心15 min（13000 rpm，4℃），取100ul上清；
3. 加入 内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）20 μL，加入400ul甲醇-乙腈（V:V =2:1），涡旋振荡1min；
4. 冰水浴超声提取10 min，-20 ℃静置30 min；
5. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取300 μL上清液装入LC-MS进样小瓶中挥干；
6. 用400μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶，加入内标（Lyso PC17:0，0.1 mg/mL，甲醇配置）10 μL，涡旋30 s，超声3 min；
7. -20℃下静置2小时；
8. 离心10 min（13000 rpm，4℃），取150 μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中；
9. 质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。
A5: 细胞（或菌体）
常用等级：★★★★★
1. 用预冷的甲醇-水（V:V=4:1）总共1 mL将样本分两次转移到玻璃小瓶中；
2. 加入200 μL氯仿，用移液枪吹散；
3. 冰浴超声破碎，500 W，3 min（6 s开，4 s关），含细胞壁的需超声6 min；
4. 将全部的液体转移到离心管中，在离心管中加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL，甲醇配置）20 μL；
5. 冰水浴超声提取20min；
6. 离心10 min（13000 rpm，4℃），取1mL装入LC-MS进样小瓶中挥干（分三次，0.4mL、0.3mL、0.3mL）；
7. 用300μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶，加入内标（Lyso PC17:0，0.1 mg/mL，甲醇配置）10 μL，涡旋30 s，超声3 min；
8. -20℃下静置2小时；
9. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取150 μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析；
10. 质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。
注：若样本液体体积不一样，可后台留言或者私聊具体操作方法。
A6: 培养液（或发酵液）
常用等级：★★★
1. 取1 mL的培养液，在5mL离心管中冻干；
2. 用300μL甲醇-水（V:V=1:4）复溶（涡旋30 s，超声3 min），加入内标（L-2-氯苯丙氨酸，0.3 mg/mL；Lyso PC17:0，0.1 mg/mL，均为甲醇配置）各20 μL，随后-20℃下静置2小时；
3. 离心10 min（13000 rpm ，4℃），取150 μL上清液装入带有支脚内衬管的LC-MS进样小瓶中进行分析；
4. 质控样本（QC）由所有样本的提取液等体积混合制备而成，QC的体积与样本相同。
B 生物学重复数
动物样本：6-8次以上生物学重复
菌体/菌液：6-8次以上生物学重复
临床样本：30次以上生物学重复，罕见病尽量多次生物学重复
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