可以用于溶解引物的溶剂有很多种，各有哪些优缺点？

如何选择呢？

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现代科研基本离不开分子实验，分子实验又基本离不开PCR，PCR肯定离不开引物了。

大多数科研机构的引物都不是自己合成的，而是跟生物公司买。引物很便宜，且时效很快，基本上本地公司的话，当天预定，1~2日即可送达。

购买引物之前，我们需要明确我们需要的引物序列，一般首选已发表的高质量论文内记载的引物，但不是所有引物都有文献支持，且有时候文献内提供的引物序列，我们买来以后，实践发现并没有达到我们满意的效果，因此需要自己设计序列，或者提供目的基因名称让生物公司帮忙设计。

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为了避免文章大杂烩，今天就只讨论收到引物的处理问题。

引物一般以冻干粉的形式发货，也有一些公司提供配好的引物溶液发货，但大多数是冻干粉的形式，这里主要讲解冻干粉引物。

至于引物为何冻干粉形式发货居多，主要是冻干粉的引物比较稳定，易于运输和保管，且可以根据实验者对溶解引物的载体、浓度需求不同，进行自定义。

冻干的引物很轻，且量很少，收到货的时候不认真看都看不到这EP管里是有东西的。

收到的引物瓶身标签里，一般会包含这些信息：

A：发货区域代码；B：生产日期； C：纳摩尔量；D：修饰名称；E：100 μM储存液加液稀释量；F：批号；G：Tm值；H：OD量；I：订单序号（孔位盒号）；J：引物名称（客户自定义名）；K：订单编号。

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一般来说，引物的储存液（母液），浓度为100μM（μM就是μmol/L的意思，M=mol/L，1μM=1pmol/μL），工作液浓度一般是10μM。

实际上，引物在不同的浓度范围内都是比较稳定的，配制的浓度可以根据自己的实验要求自行决定，但总体上浓度不要低于1μM、不要高于10μM。相比于pcr里面其他的限制因素，比如模板质量，引物质量，退火温度，延伸时间等等，引物浓度其实是相对比较宽松的一个变量的。

但为了确保自己实验的可重复性，当确认了一个浓度以后，就建议一直用这个浓度来做实验，一般10μM是比较通用的，不会有太大问题。

由于不同的引物序列不同，因此引物“出厂”的质量并不相等，可以根据引物的OD值和分子量来计算需要加入多少液体才达到100μM的浓度，但没必要学这个，一般公司都会直接给算好，在标签处标明需要加入多少液体溶解以达到100μM的浓度。

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收到引物确认好信息以后，如果不着急使用，可以先以冻干粉的“出厂形式”储存在-20℃，一般可以储存2~3年不会有太大问题。而溶解成100μM的引物，至少可以在-20℃放6个月。

正因为冻干引物很轻很少，因此收到货的时候可能有的引物在内盖上、在侧壁等，所以溶解引物的第一步是离心。

第一步：离心。引物比较轻，因此要求转速稍稍高一点点，4000转，1分钟即可。

第二步：溶解。加入适量的引物溶剂（具体加入多少量，引物标签会注明加入多少液体可以溶至100μM）。

至于选择什么溶液溶解引物，是不是一定要溶解成100μM，我在后面会展开谈谈个人看法。

第三步：充分涡旋、混匀。只用枪头吸吹不推荐，加液体的时候不需要吸吹，只需要加好液体--盖上盖子--涡旋。

第四步：分装、储存备用。为了避免引物反复冻融，因此建议适量分装，然后-20℃冻存起来。

经常使用的引物，在4℃也可以放1个月左右而不明显影响质量。

如意外将溶解好的引物放在常温实验台过了好多天，虽此时引物有降解，但对于大多数常规 PCR 扩增实验并没有太大影响，可以通过小量预实验先验证一下引物的功能。

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最后，展开谈两个点：（一）引物浓度的选择；（二）引物溶剂的选择。

（一）引物浓度的选择：如前所述，引物推荐储存液浓度为100μM，分装于-20℃冻存，主要是因为高浓度引物可以减少引物降解。

推荐的工作液浓度为10μM，一般可以在1~10μM之间没有太大问题。

但我并不是这样做的，我嫌这太费劲了。

因此我都是直接配置成10μM的溶液，分装储存，用的时候直接使用即可，不需要再稀释。

理由是本身-20℃下引物降解速度慢，且上文也说过，引物浓度是比较宽容的，因此即使10μM适当降解一些，对于PCR实验也几乎不会影响，而且我一般一个基因一次只溶解一对引物，剩下的引物仍然以冻干粉的形式冻存，使用也比较频繁，并没有因此发现问题。

也有人储存液浓度为20μM，这样兼顾了存储需要较高浓度的需求（起码20μM比10μM浓度提高了一倍），然后使用的时候只需要和无菌无酶水1：1稀释即可变成工作液浓度为10μM。这样也不需要额外动脑思考，反正就记住等体积添加水即可。这种方法比较推荐，相当于上述两种方法的兼顾。

（二）引物溶剂的选择：溶解引物的溶剂，常用的一般有三种：①TE Buffer；②无菌无酶水；③DEPC 水。

①TE缓冲液是Tris +EDTA缓冲液，这种缓冲液我们一般用作溶解剂或保持剂，主要是调控pH，TE组成浓度：10mM Tris-HCl 1mM EDTA PH=8.0，弱碱性对基因碱基具有保护性，且自带pH缓冲能力，pH值较稳定，也市面上也有成品的TE Buffer售卖。

很多引物公司会推荐使用TE缓冲液作为溶剂，原因是TE对引物具有保护作用，弱碱性可以保护引物免受降解，这对引物本身、公司产品质量有益。但TE缓冲液中的EDTA可以螯合金属离子，特别是Mg2+，对后续PCR扩增不好（扩增对金属离子有要求）。

②无菌无酶水，顾名思义，无细菌且无核酶。有的实验室直接用高压过的ddH2O替代，我们是直接买现成的，也很便宜，也有人直接用临床注射灭菌水也是ok的。但是水的pH一般在7左右，且没有缓冲能力，事实上水溶解引物以后过段时间去测pH，经常会低于7，对引物保护作用较差。

③DEPC（焦碳酸二乙酯）能够与RNase的活性基团进行反应从而抑制其活性，用来防止RNA降解。而常规的引物属于单链DNA，因此是没有必要用到DEPC的，并且DEPC在高温高压处理时能够降解产生CO2，降低水的pH值，对DNA的保存是不利的，所以不推荐使用 DEPC 水溶解引物。

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综合上述液体优缺点，再结合上文 “引物浓度的选择” 内容，推荐引物采用“稍高浓度保存+稀释至10μM使用”的模式。

这样就可以使用TE缓冲液溶解引物储存，保护引物避免或减少降解。实验过程中再使用无菌无酶水（或高压过的ddH2O）稀释。

这样可以降低TE缓冲液里的EDTA浓度，避免其对镁离子的螯合影响PCR扩增，又可以避免只用水溶解引物，水pH值不稳定导致引物降解的弊端。

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总结：

①收到引物以后，需要按以下步骤处理：4000转左右离心1分钟→参考给定的液体量溶解至储存浓度→涡旋→分装储存。

②溶解引物的液体和浓度，结合工作便利性、引物保存能力、PCR扩增能力等因素，推荐：使用TE缓冲液溶解引物至20μM，-20℃冻存。使用的时候，再用无菌无酶水等比例稀释至10μM工作液。

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