膜片钳，相信绝大多数神经生物学或药学方向的研究生都听过他的鼎鼎大名，它是评估细胞电生理活性必不可少的工具，也是神经科学研究中的基础技术之一，利用膜片钳技术可以记录可兴奋细胞（如心肌细胞、神经元、胶质细胞等）的膜电位、离子通道电流等指标，从而评估单个细胞的电生理活性或突触传递。

膜片钳记录示意图

当我们刚接触膜片钳的时候，可能就有个基本的问题，膜片钳怎么记录EPSC和IPSC？要想讲清楚这个问题，我们首先要知道，什么是EPSC or IPSC?

EPSC（Excitatory Postsynaptic Current）是兴奋性突触后电流，与突触传递相关。如图一所示，突触前神经元释放兴奋性神经递质谷氨酸，经突触间隙到达突触后膜，突触后神经元上的神经递质受体与神经递质结合，就会开放受体离子通道，产生电流，这种电流被膜片钳系统记录到就是EPSC。如果在这里，把兴奋性神经递质换成抑制性神经递质例如GABA（γ-氨基丁酸），这种电流就是IPSC（Inhibitory Postsynaptic Current）。

突触传递示意图

那么问题来了，膜片钳记录模式分为两种，电压钳和电流钳。简单的说，电压钳模式下可记录电流，电流钳模式下可记录电压。所以，EPSC or IPSC都是在电压钳模式下记录到的电流，我们怎么分辨EPSC与IPSC呢？

神经元可能接收到来自多个神经元不同的神经递质传递

我们记录的信号本质上都是时间点和幅值的集合，系统并不会直接告诉你，这些信号代表的生理意义，一切的生理意义都是我们通过观察和分析得出来的。所以，我们记录的电流也是一样，一个神经元可能同时接收到兴奋性神经递质和抑制性神经递质，因此EPSC和IPSC可能在记录过程中都会出现，所以，一般我们用阻断某一类神经递质的方法去记录单纯的EPSC或IPSC. 所以我们在文献中可以看到，通常EPSC或IPSC的记录通常伴随着某一类药物。

记录EPSC及IPSC的方法。摘自文章“Transmembrane protein 108 is required for glutamatergic transmission in dentate gyrus”

我们可以看到，在上图的文章中[1]，记录IPSC使用了CNQX和DL-AP5，阻断了谷氨酸受体的开放。记录EPSC使用了Bicuculline, 阻断了GABA受体的开放。因此，记录EPSC or IPSC取决于在记录的时候所用的药物。而在这篇文章中，我们也可以看到，记录到的EPSC也分为了sEPSC和mEPSC。

以EPSC为例，sEPSC中的s是spontaneous（自发），mEPSC则是Miniature（微小），sEPSC 和 mEPSC 这两个事件的相似之处在于它们在没有任何人工刺激的情况下发生。sEPSC 和 mEPSC 之间的区别在于，在 sSPSC 的情况下，由于突触前细胞或网络活动的内在特性，有可能发生动作电位驱动的事件。反过来，所有 mEPSC 都是在河豚毒素 （TTX） 存在下记录的，河豚毒素 （TTX） 会阻断动作电位的形成及其传播，因此 mEPSC 比 sEPSC 更“自发”事件，可以进一步用于量化囊泡释放。

我们也可以看看文献中的解释：

"Spontaneous postsynaptic currents are currents generated by action-potential-dependent and –independent release of neurotransmitter in the absence of experimental stimulation. Miniature postsynaptic currents are currents observed in the absence of presynaptic action potentials; they are thought to correspond to the response that is elicited by a single vesicle of transmitter." [2]

在一项对前额叶神经元中 sEPSC 和 mEPSC 的研究表明，它们具有相似的特征：

" In the present work, we investigated the possibility of using the characteristics of spontaneous excitatory postsynaptic currents (EPSCs) for estimation of quantum parameters of excitatory synaptic transmission in different types of neurons from rat prefrontal cortex slices. By blocking spontaneous spiking activity in slices by tetrodotoxin, we showed that spontaneous and miniature EPSCs in the prefrontal cortex neurons did not differ in their properties. Therefore, both spontaneous and miniature responses can be used for estimation of quantum parameters of excitatory synaptic transmission in this preparation. " [3]

“ 在本工作中，我们研究了使用自发性兴奋性突触后电流 （EPSC） 的特性来估计大鼠前额叶皮层切片中不同类型神经元中兴奋性突触传递的量化参数的可能性。通过河豚毒素阻断切片中的自发动作电位活动，我们表明前额叶皮层神经元中的自发性和微小 EPSC的特性没有差异。因此，在该样本中，自发和微小反应都可用于估计兴奋性突触传递的量化参数。" [3]

实验中记录的EPSC和IPSC.摘自文章“Transmembrane protein 108 is required for glutamatergic transmission in dentate gyrus”

钳制电压的不同设置。摘自文章“Transmembrane protein 108 is required for glutamatergic transmission in dentate gyrus”

当我们看这篇文章结果的时候，会发现一个有趣的现象，记录的EPSC方向向上，IPSC方向向下。再看其方法部分，我们发现，记录EPSC的时候，钳制电压设置在了-70mV，而记录IPSC的时候，钳制电压设置在了0mV。

这种记录的设置和细胞本身的内外液离子浓度和细胞内液的配方有关，当我们使用氯离子浓度比较低的配方时，此时介导产生IPSC的GABAa受体的反转电位接近静息电位，所以如果我们将钳制电流钳制在-70mV时，是很难记录到IPSC的，而当我们将钳制电流设置在0mV的时候，因为此时电位远离GABAa受体的反转电位（反转电位改天单开一篇来讲），所以我们就能记录到氯离子的内流，负离子的内流等同于正离子的外流，因此我们将其称为外向电流，方向向上。因此，我们在文献中经常能够看到向上的IPSC以及向下的EPSC.

低氯细胞内液

而当我们千辛万苦记录到了EPSC/IPSC，另一个问题又摆在我们面前，记录到的EPSC/IPSC代表的什么指标呢？

前面我们说过，EPSC/IPSC指的是突触前神经递质释放之后结合到突触后神经元受体上产生的电流，所以EPSC/IPSC的指标变化通常指示突触传递的变化。当突触前神经元接收到刺激之后，释放的神经递质增多，结合到了更多的受体上面，这个时候能够看到EPSC/IPSC的频率上升，而当突触后神经元兴奋性增加时，细胞内机制可使得受体的开放程度增加，体现在EPSC/IPSC上面就是幅度增加。因此，我们可以近似的这么认为，通常情况下，EPSC/IPSC的频率变化表征突触前效应，幅度变化表征突触后效应。

总之，EPSC及IPSC的记录和分析不是个简单的问题，大家在进行膜片钳实验之前一定要多看文献，搞清楚要记录的指标及生理意义。希望大家都能记到理想的信号！

[1]Jiao H-F, et al. Transmembrane protein 108 is required for glutamatergic transmission in dentate gyrus. Proc Natl Acad Sci 114,1177–1182(2017).

[2] Pinheiro, P. S. & Mulle, C. Presynaptic glutamate receptors: physiological functions and mechanisms of action. Nature reviews. Neuroscience 9, 423-436 (2008).

[3] Malkin, S.L. et al. Properties of Spontaneous and Miniature Excitatory Postsynaptic Currents in Neurons of the Rat Prefrontal Cortex. Comp. Ontog. Physiol. 50, 506–514(2014).

科研实验外包   想了解更多请关注：https://www.do-gene.cn/