一、实验动物：

ICR，4-6W

二、实验器材：

手术剪、手术镊、玻璃皿、泵、注射器、一次性静脉输液器

三、实验步骤：

1、先注射0.5ml肝素钠，再注射0.3ml  15%水合氯醛，将小鼠麻醉，同时防止凝血。

2、酒精消毒，用手术剪剪开小鼠皮肤，暴露腹腔，可见鲜红的肝脏，将肠挪到右侧，胰腺也挪到右侧，暴露出下方静脉血管（门静脉），再找到中间偏左腹腔静脉（下腔静脉）。

3、右手取静脉注射针平插入门静脉远端，左手用镊子夹住针头及血管，防止其脱落，右手轻轻的松开，左手保持不动，启动泵，开始导入预热至37度的无钙灌流液（G2），待充盈立起来（有的肝不明显），右手持手术剪剪断下腔静脉，放流，使血液和灌流液流出。可观察到肝叶垂下来，然后右手持镊子夹住下腔静脉，停止放流。慢慢地，肝叶又充盈立起来，待肝叶完全立起来后，右手的镊子松开，放流，这个过程不断循环，一般需要灌50-60ml。可观察到肝叶逐渐肿胀变为淡黄色，肝叶立起来的现象渐渐不明显。

4、待下腔静脉流出液接近无钙灌流液，用注射器吸取5-6ml胶原酶1稀释液（G3），接入灌肝装置，慢慢推入，尽量控制五分钟左右推完。整个期间，左手镊子一直夹住静脉插针和血管，不能松开而使静脉针脱落。（此过程需要另一个人协助完成）

5、肉眼观察到肝叶表面出现渗出、肝包膜下组织呈龟背状裂隙、组织呈弥散状时判断肝脏已被消化充分，可以终止灌流 。

6、小心剪下整个肝，放入含有基础培养基的玻璃皿内，过程要慢，轻柔。从肝叶中间轻轻撕开轻甩一下，能观察到有肝细胞掉下来。

7、吸取少量液体，台盼蓝染色，在显微镜下观察肝细胞状态及数量。

8、加入DF-12完全培养基终止胶原酶消化，用镊子撕开肝组织，轻甩，吸取液体，300r/min，5min。

9、接种，DF-12，双抗，密度控制好。

四、试剂配置

试剂        浓度（g/L）       终浓度

HEPEs           1M               5mM

EDTA          0.5M              0.5mM

Vc             10ug/ml        0.1ug/ml

CaCl2           1M                5mM

Col Ⅰ        150mg           5mg/ml

肝素钠                               50u/ml

1、HBSS (1L)：

NaCl        KCl       葡萄糖        KH2HPO4        Na2HPO4       HEPEs

8.0g        0.4g         1g              60mg              47.5mg           1.2g

2、G2液：

HBSS、EDTA（0.5mM）、Vc(0.1ug/ml)

3、G3液：

HBSS、CaCl2（5mM）、Col Ⅰ（5mg/ml）

4、Col Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ母液（过滤除菌）：

2%：称1g溶于50ml的1x PBS

5、肝素钠（过滤除菌）：

使用时的最终浓度为50 u/ml，用纯水/生理盐水/PBS稀释。可提前配好100x 母液

6、15%水合氯醛：

称取15g溶于100ml H2O

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