养了细胞后就会发现，即使是一瓶细胞，但是每个细胞的分裂时间却不一致，有些已经分裂生长完成了，有些细胞还在分裂初始，但是在大部分实验中，都需要细胞保持生长周期同步化，才能让实验数据更为精确。因此，只能进行人工干预啦。

一.有丝分裂摇脱法（Mitotic Shake-off）

原理：M期细胞变圆、贴附力下降，通过轻轻摇晃或拍击培养瓶可使M期细胞脱落

1. 取对数生长期细胞（密度5-8×10⁵/mL）

2. 加入诺考达唑 40-100 ng/mL

3. 培养10-14 h

4. 离心收集（300×g，5 min）

5. 冷PBS（4℃）洗涤2次

【关键步骤：低温促进微管解聚，增强M期阻滞】

6. 37℃温培养基洗涤1次

7. 重悬于新鲜完全培养基，37℃孵育

8. 每隔15-30 min取样，流式检测pHH3（M期标志）

9. 当M期细胞>80%时，即为同步化M期细胞

二. G0期诱导（血清饥饿法）

原理：剥夺生长因子使细胞退出周期进入G0期

1、取处于对数生长期的细胞；

2、用无血清的培养基培养24h，注：有时候完全去掉细胞发生死亡，因此可以尝试用含1%-2%FBS的培养基培养细胞24-48h；

3、用胰蛋白酶消化细胞即可收获G0期细胞

三. 双胸苷阻断法（Thymidine Double Block） — 最常用

Day 0: 接种细胞（30-40%密度）

Day 1: 第1次胸苷阻断（2 mM，16 h）

↓  PBS洗3次，换新鲜培养基

Day 2: 释放培养（9 h）

↓

第2次胸苷阻断（2 mM，16 h）

↓  PBS洗3次

Day 3: 获得同步化细胞（此时为G1/S边界）

可每隔2 h取样追踪周期进程

悬浮细胞需重点关注以下哦:

一、细胞洗涤：

1. 细胞悬液转移至离心管

2. 室温或37℃，300×g，5 min离心

3. 弃上清，轻弹管底分散细胞团

4. 加入37℃预温培养基/PBS，轻柔吹打重悬

5. 重复2-3次

二、防成团技巧：

- 使用硅化离心管

- 加入0.1-0.5 mM EDTA（不影响大多数细胞）

- 使用宽口吸头，减少机械剪切

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