1、实验试剂

DMEM、超牛血清、G418、L-谷氨酰胺、非必需氨基酸、LipofectamineTM 2000

2、实验仪器

细胞培养板，37℃细胞培养箱，离心机，Amicon Ultra-15离心过滤器

3、293FT细胞的培养

用于包装病毒的293FT细胞必须处于生长旺盛期，细胞状态良好，细胞边缘清晰，传代次数较低。293FT细胞培养：使用含10%超级新生牛血清的DMEM高糖培养基（并添加0.1mM的非必需氨基酸，2mM的L-谷氨酰胺，2mM的丙酮酸钠，500µg/ml的G418和1%的青霉素或链霉素），置于37℃、5% CO2 细胞培养箱中常规培养，保证细胞生长状态良好。

4、转染质粒

细胞铺板：用含有10%FBS的无抗生素DMEM将生长旺盛的293FT细胞以一定密度铺到培养板中，使次日密融合度达到60%左右。分别用脂质体作为转染试剂实现包装质粒和核心质粒的共转，PAX 2、pMD和核心穿梭质粒以3：1：4的比例用LipofectamineTM 2000共转293 FT细胞。转染6h后，移去细胞培养液，更换为新鲜的DMEM培养基。转染后24 h和48h分别于倒置荧光显微镜下观察转染效率并拍照，效率应达到85%以上。

5、收集病毒

转染48小时后收集含慢病毒的上清液于无菌的离心管中，3000 rpm，4 ℃离心10 min，取离心后的上清分装到新的无菌的离心管中，-80℃冰箱保存。将包装病毒的细胞培养板中加上新鲜的培养基，72h后再次收获慢病毒上清液并离心处理后于-80℃保存。

6、慢病毒滴度测定

慢病毒滴度测定：滴度测定前1天接种HeLa细胞，12孔板中细胞密度为2×105个细胞/孔，含10% FBS的DMEM为1ml/孔，第2天将500µl病毒液及含10% FBS的DMEM 500µl加入到1.5ml的离心管中混匀，并将其加入到预先种好的细胞中，37℃、5%CO2培养箱培养，48h后用流式细胞仪检测阳性率。滴度计算公式：滴度（TU/µl)=阳性率(％)×细胞总数×病毒液稀释倍数/病毒液体积（µl）。

7、慢病毒的纯化

运用Amicon Ultra-15离心过滤器进行病毒的纯化

（1）加入15ml病毒上清液到Amicon Ultra-15离心过滤器。

（2）将Amicon Ultra-15离心过滤器与另一个离心管配平后放入离心机中。

（3）4500rpm，4 ℃离心30min即可获得纯化的病毒。

文章出自：动物实验外包    想了解更多请关注：http://www.do-gene.cn/