在动物实验应用中，灌注固定技术在神经系统领域内的运用显得尤为关键和重要，相比之下，在其他组织领域内的应用则较为有限。由于该技术能有效阻止神经组织的变性，为神经系统提供了极其显著的保护作用

01 小鼠的灌注固定方法

在进行小鼠的灌流固定操作时，我通常会选择使用4号半的输液器针头。当针头插入后，可以清晰地观察到小鼠的肺部迅速充气膨胀，并且颜色逐渐转为白色。这时候针头从心轴方向精准地进入，确保针尖能够深入心尖部位大约3至4毫米。

当开始灌流时，一个关键的步骤是剪破小鼠的右心耳。首先，我会灌入约40毫升的生理盐水，以冲洗掉小鼠体内的血液。然后再灌入约20毫升的4%多聚甲醛，以确保小鼠的组织得到充分的固定。这样，整个灌流固定的过程就顺利完成了

02 大鼠灌注的固定方法

对于大鼠的灌注固定过程，首要步骤是根据其体重计算并使用2%的戊巴比妥钠进行腹腔注射麻醉。然后需开胸以暴露心脏，并向左心室内注入0.2毫升的1%肝素钠溶液，以预防血液凝固。接着经左心室行主动脉插管，使用血管钳进行固定。

插管固定后，剪开右心耳，用150毫升的生理盐水迅速冲洗血管，以清除体内的血液。然后用250毫升的4%多聚甲醛与0.01摩尔/升的磷酸盐缓冲液(pH7.40)混合液进行灌注固定。在灌注过程中注意速度采取先快后慢，整个过程大约需要50分钟。

完成灌注后取材，将组织标本放入4%的多聚甲醛固定液中保存，以确保其结构和形态的完整性当多聚甲醛进入大鼠体内时，可能会引发其四肢和尾巴的短暂抽搐。最终肝脏会逐渐发白，并伴有内脏鼓起的现象，这表示灌注固定已经成功完成。

03 脑组织免疫组化实验

1、灌注固定所用的针头，通常选择注射针头。对于大鼠的灌注，一般推荐使用10到12号针头，小鼠则可选择6、7号针头。但很重要的一点，针头的尖端应磨钝，而不是用锐利的针头。2、关于穿刺操作:在进行大鼠的灌注时，穿刺针的尖端应准确插入升主动脉内，但不宜过深。一般，在动脉内能看到针头或插入约1mm左右即可。而对于小鼠的灌注，只需将针头插入左心室内即可，不必要插入升主动脉内。这样的操作可以确保灌注过程的安全性和有效性。操作的要点如下:

第一，操作务必迅速。一旦剪开膈肌，应迅速沿腋前线剪开胸壁，并将胸前壁向上翻起，以充分暴露心脏第二，操作必须在明亮的视野下进行。确保剪开心包壁层的前壁，使升主动脉和肺动脉干的根部清晰可见从而确保穿刺针能够准确无误地进入升主动脉。

第三，在穿刺之前，请使用合适大小的血管钳轻轻夹住心室以稳定心脏位置。但夹持的力度不宜过紧，以确保心腔内留有足够的空间。之后，在心尖处轻轻旋转针头，以适当的角度插入穿刺针。也可以使用小剪刀在心尖处先剪开一个小口，再插入穿刺针。

第四，穿刺方向至关重要。应从心尖部开始，以从左下方斜向右上方的角度进行穿刺。若遇到阻力，应灵活调整方向再次尝试，切勿用力蛮插。

3、剂量控制:灌注用生理盐水的量，大鼠用50ml左右，小鼠用 10ml左右，通常以从右心耳流出的液体清亮为标准;4%多聚甲醛用量约相当于老鼠体重，例如 300 克的老鼠用 300ml左右。小鼠一般用 20.30ml。灌注速度先快后慢，可持续1-2小时，也可以稍快。取出脑组织后迅速将其放入 4% 多聚甲醛内放置4℃℃后固定 4-6 小时。

04 难点和关键点

将灌注针准确插入主动脉是灌注固定的关键步骤，同时也是一项需要细心和技巧的操作首先，精确定位主动脉的位置至关重要。为实现这一目标，我们需用温生理盐水仔细冲洗胸腔内的血液接着用眼科镊子轻夹心脏外膜(尽量减小夹持面积)，将心脏轻轻提起并偏向左上方，从而充分暴露主动脉，便于灌注针的插入。

在插入灌注针时，动作必须缓慢，针尖方向要保持稳定，避免偏向右侧而误入右心房。如果感到有阻力应及时退针，调整方向重新进针，直至成功进入主动脉。当灌注针成功进入主动脉后，可在心脏上方看到其位置。为确保稳定性，灌注针进入主动脉的长度应控制在3~5毫米，并用丝线牢固地扎紧。注意灌注针绝对不能插入左心室内。由于主动脉瓣的存在，灌注液很难进入主动脉而是沿着心室的切口流出导致灌注失败。一旦灌注针成功插入主动脉，需用剪刀精准地剪开右心耳(而非右心室)，以便流液顺利流出。在剪开心尖时，位置要把握准确，避免向右偏离而导致注失败。

05 注意事项

1、选择针头时，针头大小应与动物的种类相匹配，同时，针头尖端应磨钝，以保障操作的安全性和有效性

2、在启动灌注泵之前，请仔细检查其工作状态，确保排除管路中的气泡和空气，以预防空气栓塞的风险。

3、在暴露胸腔过程中，应首先清除升主动脉周围的脂肪组织和心外膜组织，以便更准确地插入灌注针。

4、当将针头从左心室插入升主动脉时(通常以颜色变白为成功插入的标志)，需用钳子固定住针头和升主动脉。

5、在启动灌注泵之前，请确保右心耳已经解开，同时避免对心脏的其他部位进行不必要的操作，因为这可能影响灌注的均匀性，尤其是在处理肺水肿等特殊情况下更需注意。

6、在灌注过程中，应首先注入4℃的生理盐水(以动物的肝脏发白为标准，如实验室中的大鼠大约需要250ml)，然后根据所取得的材料需要，再注入适量的多聚甲醛。

7、为了最大程度地保存目的蛋白和酶的活性，整个灌注过程中将动物放置在冰上。

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