Western Blot新手必看！还在为那些烦人的实验问题头疼吗？别急，今天就来给你揭秘6个最常见的Western Blot实验难题，让你一次搞定，轻松上手！

1、为什么蛋白质印迹条带大小与预期不同？

可能是因为翻译后修饰、翻译后切割、剪接变体和异形体，还有相对电荷的影响哦！记得考虑这些因素，才能更准确解读你的实验结果！

2、应该上样多少样品？

细胞裂解物、膜裂解物和核裂解物，每孔上样20至30µg总蛋白；纯化蛋白（重组或内源），上样10至100ng蛋白。根据样品中的蛋白质表达水平，记得适当调整哦！

3、检测重组蛋白时难以获得条带？

确保重组蛋白包含所用抗体的免疫原序列，同时让标签位于C或N末端，降低抗体无法接近表位的可能性。别忘了运行内源阳性对照，这样才能更准确地检测重组蛋白！

4、样品需要还原和变性吗？

查看数据表获取详情！Abcam抗体在还原和变性条件下测试效果更佳，但也有一些抗体在非还原条件下也表现良好。记得根据数据表选择合适的条件哦！

5、牛奶和BSA封闭有区别吗？

抗体可能对封闭剂敏感，查看数据表确定哪种封闭剂效果更好。一般来讲，BSA产生更清晰的结果，但并非总是如此。有些抗体在牛奶中效果更好，因为牛奶含有更多种类的封闭蛋白！

6、能用室温下孵育一抗1小时代替4℃过夜孵育吗？

可以尝试！但需要根据抗体进行优化。4℃过夜孵育更高效、更特异，但室温下孵育1或2小时效果也不错。记得根据自己的实验需求选择合适的方法哦！

细胞实验外包    想了解更多请关注：http://www.do-gene.cn