1. 培养容器包被，0.1%明胶在培养箱中孵育30分钟，

2. 接种诱导细胞：取对数生长期的细胞，按照2×10^4cells/c㎡的细胞密度接种至包被后的培养器皿中，于37℃，5% CO₂培养环境下培养至汇合度60-70%，弃掉上清，加入成骨诱导分化培养基。

注意事项：

（3）持续诱导至适量钙盐结节，并不是钙结节越多越好，建议在能看到细胞轮廓，上层有钙结节时终止诱导，覆盖在细胞上层一层灰状物质，染色后会出现红色。

6. 诱导评估：显微镜下观察成骨染色效果，并进行图像采集和诱导评估。

案例1：MC3T3-E1 Subclone 14细胞成骨诱导分化实验

从克隆的但是表型各异的MC3T3-E1细胞系中分离出一系列亚克隆，从含抗坏血酸培养基生长的成骨细胞中选择高或低成骨细胞分化、矿化的亚克隆。MC3T3-E1 Subclone 14在抗坏血酸和3-4mM无机磷酸盐中生长表现出高水平的成骨细胞分化能力。

诱导结果：

诱导结果：

控制细胞汇合度、明胶包被

二. 许多碎片

可能是污染、或者是膜被吹散、培养基偏黄，没有及时换液导致。

1. 一般诱导过程会历时14-21天，甚至3周往上，实验组一直是处于操作的状态，是很容易有污染的风险，需要在无菌操作上更加注意。

2. 这些碎片也有可能是成膜的细胞导致的，当我们在操作换液的时候可能力度过大导致膜变成碎片。

三. 底部贴壁细胞出现收缩聚集现象，部分视野出现空斑，或者细胞飘了碎了

成骨培养基相对来说是比较温和的，但相对于完全培养基还是有一定刺激性，细胞可能会出现某个视野下没有细胞，某个视野下细胞比较聚集的情况，或者是很多细胞飘了，可能是诱导液对于细胞来说比较刺激，如果出现上述情况，可以换回完全培养基，待细胞状态稍稍恢复，再加入诱导液继续诱导。

四. 染色后的常见问题

1.异物

（1）染色前，尽量用无钙镁的PBS清洗干净，此外需要过滤茜素红，或者将茜素红进行离心。

3. 红色比较淡，背景比较白或者只有少量钙结节。

4. 染色不均

（1）可能是铺板密度不均，铺板不均匀可能导致分化不均匀、分化比例低、分化过程中细胞漂浮等问题。

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