想研究分子海绵，但为什么双荧光素酶的结果总是阴性？

——搞定ncRNA，这些技术问题你需要额外注意！

三大类的非编码RNA（ncRNA），miRNA/lncRNA/circRNA仍然是医学基础研究领域最为火热的研究热点，大部分的研究人员在立项之初，通过查阅文献或二代测序生物信息学分析，获得了合适的研究对象，但在实验推进的过程中却遇到了重重困难。主要有以下几个原因：

1. 找错了转录本；

2. ncRNA的过表达和干扰，尤其是lncRNA/circRNA干扰很难成功实现；

3. 靶向关系检测，及内源竞争性RNA的双荧光素酶检测很难获得阳性的互补配对结果；

4. ncRNA对裸鼠皮下荷瘤的影响常常无效。

针对这些常见问题，该如何去避免？

今天我们先来聊聊，为什么lncRNA/miRNA或circRNA/miRNA的双荧光素酶的检测结果经常是阴性?

双荧光素酶的阴性

首先这项检测技术对于miRNA与mRNA靶向结合位点验证是非常适用的。但苦恼的是在检测lncRNA/miRNA或circRNA/miRNA时常为阴性的结果。

主要的原因有：

(1) 生物信息学预测得到的潜在结合位点单一。通常一个miRNA会靶向多个靶基因，或与lncRNA/circRNA存在多个结合位点。同时，由于各预测数据库算法的不同，多数据库交叉预测是很有必要的。

(2) 挑选的lncRNA和circRNA本身不具备作为分子海绵的功能。

比如lncRNA表达于细胞核内而不在胞质，表达于细胞核的lncRNA是不能作为分子海绵来吸附miRNAs的。或者它们与AGO2蛋白没有结合（AGO2是lncRNA/circRNA发挥海绵作用的指示蛋白，分别与吸附的miRNA形成circRNA/lncRNA-miRNA-AGO2蛋白的三元复合物）。

因此在做lncRNA/circRNA-miRNA双荧光素酶检测之前，你需要先做好以下工作：

1) RIP-qPCR： 检测lncRNA/circRNA是否与AGO2蛋白结合。

2) RNA pull down：对上述lncRNA/circRNA进行RNA pull down实验，拉下来的RNA进行定量PCR检测，查看是否有预测到的miRNAs。

3) FISH：查看lncRNA/circRNA与miRNA的表达是否存在共定位。

4) luciferase assay： 分别构建含与miRNA结合的lncRNA/circRNA位点区域的荧光素酶载体，及miRNA结合位点突变的荧光素酶载体。

如果前期做了lncRNA/circRNA-seq，那么可以同时做下AGO2 RIP-seq，这样交集部分的lncRNA/circRNA，既是差异表达的，同时也很可能是发挥分子海绵作用的lncRNA/circRNA。

风险提示：

1. 由于双荧光素酶载体表达出来的circRNA序列不能成环，所以做circRNA与miRNA靶向关系检测时并不能完全模拟细胞内环境，还需要其他实验来进行佐证。

2. lncRNA和circRNA一般都具有相对复杂的二级结构，而复杂的RNA二级结构可能阻止与miRNA的相互作用，因此检测结果阳性不一定能够完全说明细胞内环境也是如此，同时需要做好表达共定位及pull down等其他实验以佐证该结论。

也可以在测序前期，同时做一下lncRNA/circRNA-seq和AGO2 RIP-seq，这样重叠部分的结果便是可能发挥海绵作用的lncRNA/circRNA。

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